Ngày 31 tháng 12 năm 2009, Giáo hoàng Biển Đức XVI bổ nhiệm Linh mục Matthêu Nguyễn Văn khôi làm Giám mục Phó Giáo phận Qui Nhơn, trợ giúp giám mục Phêrô Nguyễn Soạn, 73 tuổi đang đau yếu.[3][4]

Ngày 04 tháng 02 năm 2010, lễ tấn phong cho ông tại Nhà thờ Chính Toà Quy Nhơn do Giám mục Phêrô Nguyễn Văn Nhơn – Giám mục chính tòa Giáo phận Đà Lạt kiêm Chủ tịch Hội đồng Giám mục Việt Nam chủ phong và 2 giám mục phụ phong là Giám mục Giuse Nguyễn Năng – Giám mục chính tòa Giáo phận Phát Diệm và Giám mục Giuse Nguyễn Chí Linh – Giám mục chính tòa Giáo phận Thanh Hóa.[5]

Khẩu hiệu giám mục của ông: Tình yêu Đức Kitô thúc bách chúng tôi (2Cr 5,14) (Caritas Christi urget nos).[6]

Trong nhiệm kì từ năm 2013 đến năm 2016, các giám mục Việt Nam nhất trí bầu chọn làm Chủ tịch Ủy ban Nghệ thuật Thánh thuộc Hội đồng Giám mục Việt Nam,[7] và trong nhiệm kì 2016 đến năm 2019, ông tiếp tục được tái cử vào chức vụ này.[2]

Các giám mục Việt Nam từ 27 giáo phận họp Đại hội XIV Hội đồng Giám mục Việt Nam tại trung tâm Mục vụ Giáo phận Hải Phòng vào cuối tháng 9 và đầu tháng 10 năm 2019. Trong khuôn khổ đại hội, các giám mục đã sắp xếp và bầu chọn nhân sự trong hội đồng. Kết quả, các giám mục tiếp tục chọn Giám mục Nguyễn Văn Khôi đảm trách vai trò Chủ tịch Ủy ban Nghệ thuật Thánh thuộc Hội đồng Giám mục trong nhiệm kỳ 2019 – 2022.[1]